Gli Enzimi (E) sono per la maggior parte proteine. Come abbiamo visto per le proteine se si altera la struttura, viene alterata anche la funzione.
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| 6-fosfofruttochinasi |
Alcuni E hanno già dei gruppi funzionali per agire da catalizzatori, altri necessitano di cofattori:
- ioni inorganici (Cu2+, Fe2+, K+, Mg2+, Zn2+...)
- coenzimi = portano i gruppi funzionali (es. biotina, coenzimaA, coenzima B12, FAD, NAD, piridossal fosfato, tiammina pirofosfato...)
Questi cofattori possono essere:
- gruppi prostetici se legati covalentemente all'E (quindi sempre legati)
- cosubstrati se legati debolmente all'E (quindi legati all'occorrenza)
apoenzima + cofattore → oloenzima
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| classificazione internazionale degli enzimi |
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| struttura di un enzima |
Il ligando si chiama Substrato (S).
Nel sito attivo ci sono gruppi funzionali specifici per il S.
Reazione enzimatica tipo:
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| reazione enzimatica |
descritta da questo grafico che mostra la variazione di energia al procedere della reazione:
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| grafico della coordinata di reazione |
L'energia si esprime come energia libera G.
Il punto di partenza della reazione è detto stato basale dei R o dei P (contributo di energia libera fornito al sistema dai R o dai P).
In condizioni standard biochimiche
- temperatura 298 K
- pressione parziale dei gas 1 atm
- pH 7
Nelle reazioni all'equilibrio l'energia libera dello stato basale di S è uguale a quella di P, la reazione è reversibile. AG = 0
Nb. R = S il reagente è anche il substrato dell'E.
si parla di variazione di energia libera standard biochimica.
L'equilibrio tra S e P dipende dalla differenza di energia libera degli stati basali di S e P.
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| reazione all'equilibrio |
Nelle reazioni all'equilibrio l'energia libera dello stato basale di S è uguale a quella di P, la reazione è reversibile. AG = 0
Nb. R = S il reagente è anche il substrato dell'E.
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| reazione non all'equilibrio |
Questa reazione non è spontanea e reversibile perché bisogna fornire energia (ATP) per vincere la differenza di energia dello stato basale di S, che è minore di P. AG > 0
Le reazioni catalizzate dagli E sono solo quelle spontanee con AG < 0. Infatti gli E abbassano l'Ea di attivazione ma non modificano gli equilibri delle reazioni.
Equilibrio favorevole non corrisponde ad un'alta velocità di reazione; tra S e P c'è comunque una barriera energetica (Ea = energia necessaria per creare le condizioni adatte a far partire la reazione). L'Ea è la differenza di energia tra l'energia basale di S o P e il punto più alto della curva, cioè lo stato di transizione. Lo stato di transizione è un momento molecolare transitorio in cui si sono create le condizioni favorevoli alla reazione (formazione o rottura di legami...) e c'è un'uguale probabilità di decadere verso S o P (entrambe le reazioni sono in "discesa").
La velocità è inversamente proporzionale all'Ea, aumenta abbassando l'Ea.
Come abbasso l'Ea?
- aumentando la T
- aumentando la [S]
- enzimi
Una delle caratteristiche fondamentali degli E è che non vengono consumati durante le reazioni.
La velocità è inversamente proporzionale all'Ea, aumenta abbassando l'Ea.
Come abbasso l'Ea?
- aumentando la T
- aumentando la [S]
- enzimi
Una delle caratteristiche fondamentali degli E è che non vengono consumati durante le reazioni.
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| reazione enzimatica |
Scomponendo questa reazione
vediamo che l'E non partecipa alla reazione, non viene consumato e può essere riutilizzato.
Il suo compito sta nel creare degli intermedi di reazione (ES ed EP).
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| grafico della coordinata di una reazione catalizzata |
Quando una reazione ha più tappe, la velocità complessiva è data dalla reazione con l'Ea di attivazione più alta (tappa limitante).
Abbiamo parlato di equilibri in termini di AG'° (variazione di energia libera standard) e di velocità in termini di Ea (energia di attivazione).
Sappiamo che una reazione all'equilibrio come S <--> P ha una sua Keq (costante di equilibrio) = [P]/[S].
Come correlare la Keq alla AG'°?
AG'° = - RT ln Keq
Questa espressione ci dice che la Keq è direttamente proporzionale alla AG'°: a valori molto negativi di AG'° corrispondono equilibri favorevoli; ma non abbiamo informazioni sulla velocità!
V = k [S]
L'equazione di V (velocità) di prim'ordine che ci dice che la V dipende dalla quantità di S e da una costante di velocità k (che dipende da T, pH ecc...).
V = k [S1][S2]
Equazione di V di second'ordine, ecc...
Potere catalitico degli E:
- formazione di legami deboli tra E e S per formare il complesso ES (intermedio stabile) con rilascio di energia libera (AGb = energia di legame) --> specificità e catalisi
- nel sito attivo dell'E può esserci
- la formazione di legami covalenti transitori tra i gruppi funzionali dell'E e il S che rendono il S più attivo e reattivo
- il momentaneo trasferimento di gruppi funzionali dal S all'E
Quindi l'E usa l'AGb per abbassare l'Ea.
Fisher aveva erroneamente pensato alla complementarietà ES come una chiave con la sua serratura
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| modello chiave-serratura |
Erroneamente perché un S perfettamente complementare al sito attivo del suo E non si staccherebbe facilmente da esso.
L'E non è complementare al S ma allo stato di transizione della reazione!
Il modello attualmente adottato per spiegare la formazione del complesso ES è l'adattamento indotto. L'E comincia a formare delle interazioni deboli col S. S ed E subiscono dei piccoli cambi conformazionali che portano alla formazione di altri legami deboli che:
- stabilizzano il complesso ES --> ciò giustifica la specificità dell'E per un S
- liberano energia libera sotto forma di AGb (energia di legame) --> questa energia viene usata per abbassare l'Ea, quindi per velocizzare (catalizzare) la reazione.
In questo modo si raggiunge lo stato di transizione e la reazione può avvenire in un senso o nell'altro.
La specificità è la capacità dell'E di discriminare tra un S e molecole simili.
ESEMPIO
L'E esochinasi è in grado di discriminare tra i S (glucosio e H2O) grazie alla modificazione conformazionale quando si lega il glucosio.
Catalizza il trasferimento di un gr fosforico (PO3 2-) dall'ATP al glucosio.
Quando l'E è libero, i gruppi funzionali del sito attivo non sono in posizione corretta (E inattivo). Invece nel complesso ES viene liberata l'AGb grazie ai legami col glucosio e l'E diventa attivo.
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| formazione del complesso ES |
Il modello attualmente adottato per spiegare la formazione del complesso ES è l'adattamento indotto. L'E comincia a formare delle interazioni deboli col S. S ed E subiscono dei piccoli cambi conformazionali che portano alla formazione di altri legami deboli che:
- stabilizzano il complesso ES --> ciò giustifica la specificità dell'E per un S
- liberano energia libera sotto forma di AGb (energia di legame) --> questa energia viene usata per abbassare l'Ea, quindi per velocizzare (catalizzare) la reazione.
In questo modo si raggiunge lo stato di transizione e la reazione può avvenire in un senso o nell'altro.
La specificità è la capacità dell'E di discriminare tra un S e molecole simili.
ESEMPIO
L'E esochinasi è in grado di discriminare tra i S (glucosio e H2O) grazie alla modificazione conformazionale quando si lega il glucosio.
Catalizza il trasferimento di un gr fosforico (PO3 2-) dall'ATP al glucosio.
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| esochinasi |
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| esochinasi |
Quando l'E è libero, i gruppi funzionali del sito attivo non sono in posizione corretta (E inattivo). Invece nel complesso ES viene liberata l'AGb grazie ai legami col glucosio e l'E diventa attivo.
Come gli E abbassano l'Ea?
- con l'AGb compensano la riduzione di entropia (meno libertà di movimento delle molecole in soluzione). Gli E legano il S orientandolo.
- con la loro tasca idrofobica eliminano il problema dei legami H dei S con l'acqua di solvatazione = desolvatazione del S. I legami H H2O-S vengono sostituiti con legami H ES.
Abbiamo visto che oltre ai legami deboli, l'E può formare altri legami transitori col S che contribuiscono alla catalisi:
- catalisi acido-base generale = trasferimento di H+ (protoni) per stabilizzare un intermedio carico (instabile)
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| residui Aa donatori/accettori di H+ |
- catalisi covalente: formazione di un legame covalente tra E e S, solitamente l'E si comporta da nucleofilo nei confronti del S.
- catalisi da ioni metallici: formazione di interazioni deboli (spesso legami ionici) tra un S e uno ione metallico legato +/- saldamente all'E.
ESEMPI
Chimotripsina = serin-proteasi pancreatica (aumenta la velocità della rottura idrolitica di legami peptidici).
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| chimotripsina |
2 fasi di reazione
1. acilazione = rottura del legame peptidico e formazione di un legame estere tra il peptide e l'E (intermedio acil-enzima)
2. deacilazione = idrolisi del legame estere e rigenerazione E.
Nel sito attivo della chimotripsina c'è la triade catalitica:
- Ser195
- His57
- Asp102
L'His57 e l'Asp102 sono uniti da 1 legame H.
FASE 1
Quando si forma il complesso ES si ha un cambio conformazionale che rende più forte il legame H tra His57 e Asp102. Questa situazione fa aumentare il pKa dell'His57 da 7 a 12, cioè diventa una base più forte che strappa l'H+ dal gruppo -OH della Ser195. Questa deprotonazione è funzionale per non far creare una carica + instabile sul gr -OH della Ser195, che diventa così nucleofilo (base di Lewis).
L'O- della Ser195 (ione alcossido, fortemente nucleofilo, base forte, ha un doppietto di e- libero) attacca il C del gr -C=O (elettrofilo) del S, formando un intermedio tetraedrico acil-E. L'O del gr -C=O assume una carica -. Questa carica viene stabilizzata da 2 legami H con i 2 legami ammidici della chimotripsina, 1 di questi si forma con il gr -NH della Gly193 e 1 con il gr -NH della stessa Ser195 (uso dell'AGb per la catalisi).
L'O del gr -C=O resta instabile e ciò provoca il riformarsi del doppio legame C=O e la rottura del legame peptidico!
L'His57 che nella prima fase si comporta da base, successivamente diventa un acido (donatore di H+), protona il gr N-terminale uscente del S, facilitandone il distacco.
FASE 2
Inverso della precedente
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| azione della chimotripsina |
Il lisozima è un battericida naturale che si trova nelle lacrime e nella saliva.
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| lisozima |
E' una glicosidasi, cioè idrolizza i legami glicosidici. In particolare rompe i legami Beta glicosidici C1-NAM C4-NAG nel peptidoglicano dei batteri.
6 residui NAM-NAG si legano al sito attivo del lisozima.
I residui catalitici nel sito attivo sono:
- Glu35
- Asp52
La reazione complessiva è una sostituzione nucleofila: il gr -OH dell'H2O sostituisce il NAG al C1 del NAM.
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| glicosilazione |
Sono stati ipotizzati 2 meccanismi:
- SN1 = meccanismo dissociativo
- SN2 = spostamento diretto
La cinetica enzimatica dipende da:
- [S] sulla Vo (velocità iniziale)
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| curva di saturazione dell'E |
Quando siamo all'inizio di una reazione e la [S] è bassa, la Vo aumenta in modo lineare con l'aumento del S.
A [S] elevate la Vo non aumenta più di tanto, fino ad arrivare ad un punto in cui aumentando la [S] la velocità non aumenta più e si avvicina a Vmax.
La prima tappa di una reazione S --> P catalizzata da un E, vede la formazione di un complesso ES
E + S <--> ES
questa reazione è reversibile e veloce.
- E + S --> ES ha una costante di velocità k1
- ES --> E + S ha una costante di velocità k-1
La seconda tappa della reazione vede la formazione del P
ES <--> E + P
questa reazione è più lenta (tappa limitante), quindi la reazione dipende dalla demolizione di [ES].
- ES --> E + P ha una costante di velocità k2
- E + P --> EP ha una costante di velocità k-2
Vmax = [S] a cui tutto l'E è saturato (ES).
Quando la [ES] rimane pressoché costante abbiamo raggiunto lo stato stazionario.
La Vo che studiamo è quella riferita allo stato stazionario = cinetica dello stato stazionario.
L'equazione di Michaelis-Menten mette in relazione la Vo e la [S] e che descrive l'iperbole del grafico di saturazione dell'E
Vo = Vmax [S] / Km + [S]
Ipotizzando che la velocità dell'intera reazione dipenda da [ES], poiché la tappa limitante è ES --> E + P.
Questa reazione è considerata in questo momento irreversibile perché siamo ai primi momenti della reazione e la [P] è trascurabile.
Vo = k2 [ES]
k1 = costante di formazione [ES]
k-1 e k2 = costanti di scissione [ES]
velocità di formazione ES = Vf [ES] = k1 [E] [S]
[Et] = [E] + [ES] --> [E] = [Et] - [ES]
Et = enzima totale
sostituendo:
Vf [ES] = k1 ([Et] - [ES]) [S]
velocità di scissione ES = Vs [ES] = k-1 [ES] + k2 [ES]
Assunzione dello stato stazionario: siccome siamo all'inizio della reazione la [ES] è costante, quindi Vf = Vs.
k1 ([Et] - [ES]) [S] = k-1 [ES] + k2 [ES]
Sapendo che Vo = k2 [ES], possiamo sostituire [ES]:
Siccome Vmax è la velocità raggiunta quando tutto l'E è saturato col S ed è = k2 [Et], sostituendo:
equazione della velocità di Michaelis-Menten (M&M).
Es di applicazioni
Km = [S] quando Vo = Vmax/2
dividendo per Vmax:
Quindi Km è la [S] a cui Vo = Vmax/2.
Quando [S] è bassa, Km >> [S] e Vo dipende linearmente da [S]
Quando [S] è alta, [S] >> Km e Vo = Vmax
Facendo il reciproco di entrambi i membri dell'equazione di M&M
Separando i componenti e semplificando
otteniamo l'equazione di Lineweaver-Burk, cioè l'equazione di una retta
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| grafico dei doppi reciproci |
Km/Vmax = la pendenza della retta
1/Vmax = intercetta sull'asse delle Y
- 1/Km = intercetta sull'asse X
Questo grafico e la sua equazione sono utili per determinare sperimentalmente il valore di Vmax e per analizzare l'inibizione enzimatica.
Spesso il valore di Km viene usato come indicatore dell'affinità dell'E per il suo S, in realtà questo è vero solo se k2 << k-1, e cioè quando k2 diventa trascurabile e Km = k-1/k1 = Kd.
Kd = costante di dissociazione di ES.
Km bassa: alta affinità dell’E per il S;
Km alta: bassa affinità dell'E per il S.
Km bassa: alta affinità dell’E per il S;
Km alta: bassa affinità dell'E per il S.
Quando abbiamo visto la tappa limitante di una reazione, abbiamo detto che è quella che avviene più lentamente rallentando l'intera reazione. Nel nostro es. era la costante di velocità (k2) della reazione di scissione di ES a dare E + P. Ma in reazioni più complesse la costante di velocità potrebbe essere k3 o k4...Quindi usando un termine più generico la costante di velocità della tappa limitante sarà indicata come kcat.
Vmax = k2 [Et] --> kcat [Et]
kcat è detto anche numero di turnover = numero di molecole di S convertite in P nell'unità di tempo da un E saturato col suo S.
Ogni E ha i suoi valori di Km e kcat.
Per valutare l'efficienza catalitica di E diversi o dello stesso E con diversi S, basta fare kcat/Km, ottenendo così la costante di specificità di ogni E.
