La funzione delle proteine: l'emoglobina

Le cellule responsabili del trasporto di O nel sangue sono gli eritrociti (emazie o globuli rossi), dei dischi biconcavi di 6-9 micron di diametro.

All'interno del loro citoplasma è disciolto un enorme quantitativo di Hb, prodotta dagli emocitoblasti. Gli eritrociti infatti sono una vestigia di cellule che hanno perso tutti gli organuli e hanno una vita media di 120 giorni.

Nel sangue arterioso la saturazione di O è al 96%, nel sangue venoso al 64%.

eritrocita ossigenato e deossigenato

circolazione sanguigna

Un singolo monomero dei 4 dell'Hb è molto simile alla Mb.

Mb

Hb

I 4 monomeri dell'Hb sono tenuti insieme da interazioni idrofobiche, legami H e diverse interazioni ioniche (ponti salini) a formare un tetramero alfa2beta2.

L'Hb è una proteina globulare con struttura quaternaria che presenta i residui amminoacidici idrofobici all'interno della proteina e quelli idrofilici esposti all'esterno.

Come la Mb anche l'Hb ha come gruppo prostetico l'EME (1 per ogni subunità, quindi 4 gr EME).

confronto stato R e stato T

Il Fe (come abbiamo già visto) è un metallo di transizione in cui c'è un ritardo nel riempimento degli orbitali d.

Nel suo stato di ossidazione ferroso, Fe2+, perde i 2 elettroni dell'orbitale 4s.

Il Fe ad "alto spin" non si trova nel piano dell'EME a causa delle sue dimensioni e dell'impedimento sterico della Val nell'ansa FG, quindi sovrasta il piano dell'EME di 0,6 A.

legame dell'O al Fe e transizione di spin

Quando l'O si lega al Fe2+, questo transita nella conformazione elettronica a basso spin per forza di campo di ligando, diventa più piccolo e si fa spazio nel piano dell'EME.

Il Fe trascina con sé l'elica F, causando la rottura dei ponti salini.

alcuni ponti salini tra le subunità dell'Hb

l'Hb "respira" transitando da T a R e viceversa

La tecnica del salting-out applicata all'Hb per dimostrare i cambi conformazionali T-->R

1. si fanno scoppiare gli eritrociti in soluzione ipotonica in assenza di O

2. si esegue centrifugazione differenziale --> la membrana e gli organuli pesanti sul fondo della provetta, l'Hb nel sovranatante

3. trattamento con i sali (solfato di ammonio) per il salting out --> l'Hb precipita

4. dopo 24/48 h in frigo si formano i cristalli di Hb

5. esponendo i cristalli di Hb all'aria (quindi all'O), questi si frantumano proprio a dimostrazione del cambio conformazionale T --> R.

La transizione dallo stato T (a bassa affinità per l'O) ad uno stato R (ad alta affinità per l'O) è importante per il ruolo di trasportatore dell'Hb. L'Hb deve avere alta affinità per l'O nei polmoni, dove si carica e bassa affinità nei tessuti dove si scarica di O.

Il risultato di questa transizione è una curva di di saturazione sigmoidale.

curva di saturazione dell'Hb

Una proteina con un solo monomero (Mb) non può produrre una sigmoide (infatti ha una curva ad andamento iperbolico). In una proteina con più subunità, il legame dell'O ad una subunità modifica l'affinità delle subunità adiacenti per il ligando.

La prima molecola di O incontra delle difficoltà a legarsi all'Hb (TAPPA LIMITANTE) a causa della bassa affinità per l'O dello stato T. Ma questo legame induce un cambio conformazionale che facilita il legame dell'O alla subunità successiva.

Il legame O-Hb diventa via via più facile.

L'O è un modulatore allosterico per l'Hb (proteina allosterica). Siccome l'O è sia il naturale ligando dell'Hb che un modulatore positivo l'interazione viene detta omotropica.

Il CO è un modulatore allosterico inibitore eterotropico.

La curva sigmoide, ovvero il passaggio da bassa ad alta affinità della proteina per il suo ligando, riflette l'esistenza di un legame cooperativo, cioè l'Hb è sensibile a piccole variazioni di pO2.

Come abbiamo già visto per la Mb il legame Hb-O è reversibile e quindi può essere descritto da una Ka (costante di associazione)

Hb + O2 == HbO2

Ka = [HbO2] / [Hb] [O2]

Volendo valutare il valore frazionario Y

Y = siti occupati / siti totali = [HbO2] / [HbO2] [Hb]

e sapendo che [HbO2] = Ka [Hb] [O2]

Otteniamo

dividiamo tutti i membri per Ka

Sappiamo che 1/Ka = Kd (costante di dissociazione)

Invertiamo tutti i membri

separiamoli

otteniamo

Siccome 1 = Y/Y

re-invertiamo i membri

applichiamo i logaritmi,sapendo che il log di un rapporto è uguale alla differenza tra il log del numeratore e il log del denominatore

Sapendo che l'O2 è un gas parleremo di pO2 e sapendo che la Kd è uguale alla p50

questa è l'equazione di Hill che descrive il grafico di Hill

grafico di Hill

Questo grafico ci permette di valutare la cooperatività di legame sulla base di n (coefficiente di Hill). Se n=1 come nella Mb non c'è cooperatività, se n=3 come nell'Hb c'è cooperatività. 

Nb. Nota che 3 è un valore minore ai siti di legame dell'Hb per l'O (4).

Esistono 2 modelli per spiegare il legame cooperativo:

1. modello concertato (tutto o niente): tutte le subunità hanno la stessa conformazione (T o R), ad alta pO2 è favorito lo stato R, a bassa pO2 è favorito lo stato T.

modello concertato

2. modello sequenziale: il legame con il ligando induce una modifica conformazionale in una subunità della proteina che induce una modifica simile nella subunità adiacente e così via.

modello sequenziale

Oltre all'O il Fe2+ può legare anche CO, NO e CN, che impediscono il legame con l'O.

Il CO si lega 200 volte meglio alla Hb dell'O, formando la carbossiHb.

HbCO

Questa relativa "bassa affinità" del CO è dovuta all'HisE7 (istidina 64 distale) che distorce il legame Fe-CO, creando un angolo innaturale (dato il triplo legame nel CO e la sua ibridazione sp).

L'O invece forma naturalmente un angolo di 120° con il piano dell'EME (data la sua ibridazione sp2) e lega l'HisE7 in una conformazione che ne adatta la presenza all'interno della proteina.
L'HisE7 si comporta come una porta che si apre e si chiude quando l'O entra nella tasca idrofobica dell'EME.

HisE7

NB. questa "bassa affinità" del CO è molto importante nell'Hb perché il CO è un prodotto del nostro metabolismo, nonché il prodotto del fumo di tabacco.
La HbCO nei soggetti normali è l'1% dell'Hb totale, nei fumatori dal 3 al 15%.
L'HbF (fetale) ha un'ancor maggiore affinità per CO. I feti sono particolarmente a rischio di avvelenamento da CO.

L'Hb trasporta anche CO2 e H+ (prodotti di scarto del metabolismo cellulare) dai tessuti periferici ai polmoni/reni.

La CO2 non è solubile e quindi viene idratata come bicarbonato dall'enzima anidrasi carbonica negli eritrociti per essere trasportata:

La formazione di bicarbonato (HCO3-) porta alla liberazione di H+, con conseguente diminuzione del pH.

La CO2 e il pH sono 2 fattori che influenzano il legame dell'O all'Hb. Il legame CO2 e H+ all'Hb è inversamente proporzionale al legame con l'O --> effetto Bohr.

L'effetto Bohr costituisce un sistema isoprotico (in cui i protoni non si muovono) di tamponamento del pH (l'acidità a livello tissutale viene liberata a livello polmonare).

La [CO2] e [H+] nei tessuti, abbassano l'affinità dell'Hb per l'O. Nei tessuti periferici l'O viene liberato e l'Hb si carica di CO2 e H+.

effetto Bohr

Il pH nei polmoni è 7,6 mentre nei tessuti è 7,2, nel sangue è 7,4.

La CO2 si lega a siti diversi dal sito di legame dell'O.

L'Hb può legare 4 CO2 sui suoi 4 residui N-terminali di ciascuna subunità, formando la carbamminoHb.

—NH3+ + CO2       -->         —NHCOOH + H+

I carbammati favoriscono la formazione di ponti salini, stabilizzando lo stato T.
Questa reazione produce H+.

RIP. destino della CO2:

RIP.
Gli H+ sono prodotti da:
- metabolismo cellulare
- formazione di bicarbonato a partire da CO2 e H2O
- formazione dei carbammati a partire dagli N-terminali e CO2.

Anche gli H+ non si legano allo stesso sito di legame dell'O, ma ad alcuni residui amminoacidici delle proteine.

alcuni ponti salini tra le subunità dell'Hb

Il maggior contributo all'effetto Bohr è dato dall'His 146 che quando si protona (His146+) forma un ponte salino con l'Asp94- sulle subunità beta1 e beta2.

La catena laterale R dell'His è ionizzabile, ha pKa 6.0 e pI 7,59

curva di titolazione dell'His

Ciò vuol dire che a pH 7,6 nei pomoni l'His è priva di carica netta e i ponti salini si rompono, a pH inferiori come nei tessuti l'His è protonata e forma ponti salini.

I ponti salini sono 8 e possono essere intercatena (His-Lys e Arg-Asp) o intracatena (Asp-His).

Un altro modulatore allosterico eterotropico è il 2,3 BPG (2,3 BiPhosphoGlicerato), che riduce l'affinità dell'Hb per l'O.

2,3 BPG

Il 2,3 BPG è importante per l'adattamento ad alta quota dove la pO2 è scarsa, infatti nei soggetti che stanno in montagna la [2,3BPG] è più alta (8mM) di quella dei soggetti che stanno a mare (5mM). Questo avviene per garantire un uguale rilascio di O nei tessuti periferici.

L'ipossia è una condizione patologica di mancanza di O per cui aumenta la [2,3BPG].

effetto Bohr

Come si può vedere dal grafico una bassa [2,3BPG] rende la curva di saturazione dell'Hb quasi iperbolica!

Per questo a mare la saturazione dell'Hb è maggiore che in montagna, ma il rilascio di O nei tessuti è quasi identico.

Una sola molecola di 2,3BPG con 4 cariche - forma dei legami ionici coi residui amminoacidici carichi + nella cavità tra le 2 catene Beta dell'Hb nello stato T. Nello stato R la cavità tra le 2 catene Beta si restringe e il 2,3BPG non può più formare legami ionici con i gruppi R carichi +.

L'HbF (fetale) si comporta come la Mb, ha maggiore affinità per l'O dell'Hb, infatti "strappa" l'O alla circolazione materna. Questo è permesso dal fatto che il 2,3BPG non ha siti di legame sull'HbF, perché l'HbF non ha le 2catene Beta, ma ha 2 catene Gamma (alfa2gamma2).

tetramero alfa2gamma2 dell'HbF

nota la somiglianza della curva di saturazione dell'HbF con quella della Mb

RIP. la respirazione:

- pO2 dell'ambiente esterno 152 mmHg

- pO2 alveoli polmonari 100 mmHg = saturazione quasi completa dell'Hb

- pO2 capillari 20-40 mmHg = rilascio di O da parte dell'Hb, saturazione quasi completa della Mb

- pO2 citosol 10 mmHg 

- pO2 mitocondriale 1 mmHg = la Mb cede l'O

Nb. il processo di ossigenazione è ineluttabile, una volta cominciato va a compimento!

Emoglobinopatie:
L'anemia falciforme è causata da una singola sostituzione amminoacidica  (Glu --> Val) nelle catene Beta.

Il Glu è carico negativamente a pH fisiologico, mentre la Val è priva di carica netta.

Glu

Val

L'HbS (falciforme) ha 2 cariche negative in meno rispetto all'HbA, non è più possibile la formazione di legami ionici, ma si creano legami idrofobici (data l'idrofobicità della Val) sulla superficie esterna delle 2 catene Beta.

Questa situazione porta alla formazione di aggregati di fibre che schiacciano la proteina.

forma a falcetto degli eritrociti

Si tratta di una malattia genetica che per manifestarsi necessita l'omozigosi recessiva.

I portatori manifestano una forma "blanda" di anemia.

I malati hanno crisi dolorose post-sforzo, fiato corto, stati confusionali, debolezza e problemi cardiaci. L'Hb è la metà del valore normale (15 g/100 mL).

Il comportamento dell'Hb viene studiato mediante elettroforesi:

1. centrifugazione per allontanare i globuli rossi dal plasma sanguigno

2. lisi dei globuli rossi in soluzione ipotonica

3. ulteriore centrifugazione per separare l'Hb

4. sottoponiamo ad elettroforesi l'Hb di un soggetto sano, di un soggetto portatore e di un soggetto malato

5. effettuiamo il fingerprinting (impronta digitale) dell'Hb per capirne il malfunzionamento 

- digestione triptica di un'Hb sana

- elettroforesi dei piccoli frammenti di Hb che abbiamo ottenuto

- cromatografia per migliorare la risoluzione

- confronto. I fingerprinting di Hb uguali saranno uguali (stessi Aa che si comportano nello stesso modo), le analisi saranno sovrapponibili. Il fingerprinting di HbS non è sovrapponibile a causa di un Aa diverso.

Attraverso la degradazione di Edman si noterà che c'è una Val dove ci dovrebbe essere un Glu.

Forme di Hb nelle varie fasi di sviluppo

Altre patologie legate alla struttura primaria:

HbK (Kansas) difficilmente compatibile con la vita per sostituzione Asn 102 della catena Beta con Thr, alla pO2 a cui si dovrebbe saturare al 100% si satura al 35-40%.

HbR (Ranieri) sostituzione Tyr 145 della catena Beta con Cys, Hb troppo affine all'O, si comporta come la Mb.

Le talassemie sono malattie genetiche in cui vi è mancata o errata produzione di catene alfa o beta:

- alfa talasseime

- beta talassemie

Come ho già accennato per la Mb, il Fe nel gr EME si trova nello stato di ossidazione Fe2+, se dovesse transitare nello stato Fe3+ non sarebbe più in grado di legare l'O (metaHb).

La HbM è una condizione fisiologica finché rappresenta il 2% dell'Hb totale, la concentrazione di HbM si mantiene bassa perché quel poco che si forma viene subito ridotta.

Il GSH (glutatione) è il principale agente riducente negli eritrociti, è un tripeptide Gly-Cys-Glu.

Il legame Cys-Glu è particolare perché non è il normale legame peptidico tra il gr alfa amminico e il gr alfa carbossilico, si tratta invece di un legame alfa amminico-gamma carbossilico (il gr COOH della catena laterale del Glu).

GSH ridotto

Il GSH si ossida formando un legame S-S con un altro GSH

GSH ossidato

L'ossidazione libera 2 equivalenti di riduzione (2H+ e 2e-) che fanno transitare l'HbM in Hb.

Un altro sistema per mantenere il Fe ridotto è l'enzima HbM reduttasi NADH-dipendente:

L'HbM non lega l'O ma l'OH- per neutralizzare la carica + in più del Fe3+, questo porta alla formazione dei ROS (specie radicaliche dell'O):

O2- ione superossido

OH- ione idrossido.