Gli Enzimi

Gli Enzimi (E) sono per la maggior parte proteine. Come abbiamo visto per le proteine se si altera la struttura, viene alterata anche la funzione.

6-fosfofruttochinasi

Alcuni E hanno già dei gruppi funzionali per agire da catalizzatori, altri necessitano di cofattori:
- ioni inorganici (Cu2+, Fe2+, K+, Mg2+, Zn2+...)
- coenzimi = portano i gruppi funzionali (es. biotina, coenzimaA, coenzima B12, FAD, NAD, piridossal fosfato, tiammina pirofosfato...)

Questi cofattori possono essere:
- gruppi prostetici se legati covalentemente all'E (quindi sempre legati)
- cosubstrati se legati debolmente all'E (quindi legati all'occorrenza)

apoenzima + cofattore → oloenzima

Classificazione

classificazione internazionale degli enzimi

Nomenclatura degli E

struttura di un enzima

Il ligando si chiama Substrato (S).

Nel sito attivo ci sono gruppi funzionali specifici per il S.

Reazione enzimatica tipo:

reazione enzimatica

descritta da questo grafico che mostra la variazione di energia al procedere della reazione:

grafico della coordinata di reazione

L'energia si esprime come energia libera G.

Il punto di partenza della reazione è detto stato basale dei R o dei P (contributo di energia libera fornito al sistema dai R o dai P).

In condizioni standard biochimiche

- temperatura 298 K

- pressione parziale dei gas 1 atm

- pH 7

si parla di variazione di energia libera standard biochimica.

L'equilibrio tra S e P dipende dalla differenza di energia libera degli stati basali di S e P.

reazione all'equilibrio

Nelle reazioni all'equilibrio l'energia libera dello stato basale di S è uguale a quella di P, la reazione è reversibile. AG = 0

Nb. R = S il reagente è anche il substrato dell'E.

reazione non all'equilibrio

Questa reazione non è spontanea e reversibile perché bisogna fornire energia (ATP) per vincere la differenza di energia dello stato basale di S, che è minore di P. AG > 0

Le reazioni catalizzate dagli E sono solo quelle spontanee con AG < 0. Infatti gli E abbassano l'Ea di attivazione ma non modificano gli equilibri delle reazioni.

Equilibrio favorevole non corrisponde ad un'alta velocità di reazione; tra S e P c'è comunque una barriera energetica (Ea = energia necessaria per creare le condizioni adatte a far partire la reazione). L'Ea è la differenza di energia tra l'energia basale di S o P e il punto più alto della curva, cioè lo stato di transizione. Lo stato di transizione è un momento molecolare transitorio in cui si sono create le condizioni favorevoli alla reazione (formazione o rottura di legami...) e c'è un'uguale probabilità di decadere verso S o P (entrambe le reazioni sono in "discesa").
La velocità è inversamente proporzionale all'Ea, aumenta abbassando l'Ea.
Come abbasso l'Ea?
- aumentando la T
- aumentando la [S]
- enzimi

Una delle caratteristiche fondamentali degli E è che non vengono consumati durante le reazioni.

reazione enzimatica

Scomponendo questa reazione

vediamo che l'E non partecipa alla reazione, non viene consumato e può essere riutilizzato.
Il suo compito sta nel creare degli intermedi di reazione (ES ed EP).

grafico della coordinata di una reazione catalizzata

Quando una reazione ha più tappe, la velocità complessiva è data dalla reazione con l'Ea di attivazione più alta (tappa limitante).

Abbiamo parlato di equilibri in termini di AG'° (variazione di energia libera standard) e di velocità in termini di Ea (energia di attivazione).

Sappiamo che una reazione all'equilibrio come S <--> P ha una sua Keq (costante di equilibrio) = [P]/[S].

Come correlare la Keq alla AG'°?

AG'° = - RT ln Keq

Questa espressione ci dice che la Keq è direttamente proporzionale alla AG'°: a valori molto negativi di AG'° corrispondono equilibri favorevoli; ma non abbiamo informazioni sulla velocità!

V = k [S]

L'equazione di V (velocità) di prim'ordine che ci dice che la V dipende dalla quantità di S e da una costante di velocità k (che dipende da T, pH ecc...).

V = k [S1][S2]

Equazione di V di second'ordine, ecc...

Potere catalitico degli E:

- formazione di legami deboli tra E e S per formare il complesso ES (intermedio stabile) con rilascio di energia libera (AGb = energia di legame) --> specificità e catalisi

- nel sito attivo dell'E può esserci

1. la formazione di legami covalenti transitori tra i gruppi funzionali dell'E e il S che rendono il S più attivo e reattivo
2. il momentaneo trasferimento di gruppi funzionali dal S all'E

Quindi l'E usa l'AGb per abbassare l'Ea.

Fisher aveva erroneamente pensato alla complementarietà ES come una chiave con la sua serratura

modello chiave-serratura

Erroneamente perché un S perfettamente complementare al sito attivo del suo E non si staccherebbe facilmente da esso.

L'E non è complementare al S ma allo stato di transizione della reazione! 

formazione del complesso ES

Il modello attualmente adottato per spiegare la formazione del complesso ES è l'adattamento indotto. L'E comincia a formare delle interazioni deboli col S. S ed E subiscono dei piccoli cambi conformazionali che portano alla formazione di altri legami deboli che:
- stabilizzano il complesso ES --> ciò giustifica la specificità dell'E per un S
- liberano energia libera sotto forma di AGb (energia di legame) --> questa energia viene usata per abbassare l'Ea, quindi per velocizzare (catalizzare) la reazione.
In questo modo si raggiunge lo stato di transizione e la reazione può avvenire in un senso o nell'altro.

La specificità è la capacità dell'E di discriminare tra un S e molecole simili.

ESEMPIO
L'E esochinasi è in grado di discriminare tra i S (glucosio e H2O) grazie alla modificazione conformazionale quando si lega il glucosio.
Catalizza il trasferimento di un gr fosforico (PO3 2-) dall'ATP al glucosio.

esochinasi

esochinasi

Quando l'E è libero, i gruppi funzionali del sito attivo non sono in posizione corretta (E inattivo). Invece nel complesso ES viene liberata l'AGb grazie ai legami col glucosio e l'E diventa attivo.

Come gli E abbassano l'Ea?
- con l'AGb compensano la riduzione di entropia (meno libertà di movimento delle molecole in soluzione). Gli E legano il S orientandolo.
- con la loro tasca idrofobica eliminano il problema dei legami H dei S con l'acqua di solvatazione = desolvatazione del S. I legami H H2O-S vengono sostituiti con legami H ES.

Abbiamo visto che oltre ai legami deboli, l'E può formare altri legami transitori col S che contribuiscono alla catalisi:
- catalisi acido-base generale = trasferimento di H+ (protoni) per stabilizzare un intermedio carico (instabile)

residui Aa donatori/accettori di H+

- catalisi covalente: formazione di un legame covalente tra E e S, solitamente l'E si comporta da nucleofilo nei confronti del S.

- catalisi da ioni metallici: formazione di interazioni deboli (spesso legami ionici) tra un S e uno ione metallico legato +/- saldamente all'E.

ESEMPI
Chimotripsina = serin-proteasi pancreatica (aumenta la velocità della rottura idrolitica di legami peptidici).

chimotripsina

2 fasi di reazione
1. acilazione = rottura del legame peptidico e formazione di un legame estere tra il peptide e l'E (intermedio acil-enzima)
2. deacilazione = idrolisi del legame estere e rigenerazione E.

Nel sito attivo della chimotripsina c'è la triade catalitica:
- Ser195
- His57
- Asp102
L'His57 e l'Asp102 sono uniti da 1 legame H.
FASE 1
Quando si forma il complesso ES si ha un cambio conformazionale che rende più forte il legame H tra His57 e Asp102. Questa situazione fa aumentare il pKa dell'His57 da 7 a 12, cioè diventa una base più forte che strappa l'H+ dal gruppo -OH della Ser195. Questa deprotonazione è funzionale per non far creare una carica + instabile sul gr -OH della Ser195, che diventa così nucleofilo (base di Lewis).
L'O- della Ser195 (ione alcossido, fortemente nucleofilo, base forte, ha un doppietto di e- libero) attacca il C del gr -C=O (elettrofilo) del S, formando un intermedio tetraedrico acil-E. L'O del gr -C=O assume una carica -. Questa carica viene stabilizzata da 2 legami H con i 2 legami ammidici della chimotripsina, 1 di questi si forma con il gr -NH della Gly193 e 1 con il gr -NH della stessa Ser195 (uso dell'AGb per la catalisi).
L'O del gr -C=O resta instabile e ciò provoca il riformarsi del doppio legame C=O e la rottura del legame peptidico!
L'His57 che nella prima fase si comporta da base, successivamente diventa un acido (donatore di H+), protona il gr N-terminale uscente del S, facilitandone il distacco.
FASE 2
Inverso della precedente

azione della chimotripsina

Il lisozima è un battericida naturale che si trova nelle lacrime e nella saliva.

lisozima

E' una glicosidasi, cioè idrolizza i legami glicosidici. In particolare rompe i legami Beta glicosidici C1-NAM C4-NAG nel peptidoglicano dei batteri.
6 residui NAM-NAG si legano al sito attivo del lisozima.
I residui catalitici nel sito attivo sono:
- Glu35
- Asp52
La reazione complessiva è una sostituzione nucleofila: il gr -OH dell'H2O sostituisce il NAG al C1 del NAM.

glicosilazione

Sono stati ipotizzati 2 meccanismi:
- SN1 = meccanismo dissociativo
- SN2 = spostamento diretto


La cinetica enzimatica dipende da:
- [S] sulla Vo (velocità iniziale)

curva di saturazione dell'E

Quando siamo all'inizio di una reazione e la [S] è bassa, la Vo aumenta in modo lineare con l'aumento del S. 

A [S] elevate la Vo non aumenta più di tanto, fino ad arrivare ad un punto in cui aumentando la [S] la velocità non aumenta più e si avvicina a Vmax.

La prima tappa di una reazione S --> P catalizzata da un E, vede la formazione di un complesso ES

E + S <--> ES

questa reazione è reversibile e veloce.

- E + S --> ES ha una costante di velocità k1

- ES --> E + S ha una costante di velocità k-1

La seconda tappa della reazione vede la formazione del P

ES <--> E + P

questa reazione è più lenta (tappa limitante), quindi la reazione dipende dalla demolizione di [ES].

- ES --> E + P ha una costante di velocità k2

- E + P --> EP ha una costante di velocità k-2

Vmax = [S] a cui tutto l'E è saturato (ES).

Quando la [ES] rimane pressoché costante abbiamo raggiunto lo stato stazionario.

La Vo che studiamo è quella riferita allo stato stazionario = cinetica dello stato stazionario.

L'equazione di Michaelis-Menten mette in relazione la Vo e la [S] e che descrive l'iperbole del grafico di saturazione dell'E

Vo = Vmax [S] / Km + [S]

Ipotizzando che la velocità dell'intera reazione dipenda da [ES], poiché la tappa limitante è ES --> E + P.

Questa reazione è considerata in questo momento irreversibile perché siamo ai primi momenti della reazione e la [P] è trascurabile.

Vo = k2 [ES]

k1 = costante di formazione [ES]

k-1 e k2 = costanti di scissione [ES]

velocità di formazione ES = Vf [ES] = k1 [E] [S]

[Et] = [E] + [ES] --> [E] = [Et] - [ES] 

Et = enzima totale

sostituendo: 

Vf [ES] = k1 ([Et] - [ES]) [S]

velocità di scissione ES = Vs [ES] = k-1 [ES] + k2 [ES]

Assunzione dello stato stazionario: siccome siamo all'inizio della reazione la [ES] è costante, quindi Vf = Vs.

k1 ([Et] - [ES]) [S] = k-1 [ES] + k2 [ES]

Sapendo che Vo = k2 [ES], possiamo sostituire [ES]:

Siccome Vmax è la velocità raggiunta quando tutto l'E è saturato col S ed è = k2 [Et], sostituendo:

equazione della velocità di Michaelis-Menten (M&M).

Es di applicazioni

Km = [S] quando Vo = Vmax/2

dividendo per Vmax:

Quindi Km è la [S] a cui Vo = Vmax/2.

Quando [S] è bassa, Km >> [S] e Vo dipende linearmente da [S]

Quando [S] è alta, [S] >> Km e Vo = Vmax

Facendo il reciproco di entrambi i membri dell'equazione di M&M

Separando i componenti e semplificando

otteniamo l'equazione di Lineweaver-Burk, cioè l'equazione di una retta

grafico dei doppi reciproci

Km/Vmax = la pendenza della retta

1/Vmax = intercetta sull'asse delle Y

- 1/Km = intercetta sull'asse X

Questo grafico e la sua equazione sono utili per determinare sperimentalmente il valore di Vmax e per analizzare l'inibizione enzimatica.

Spesso il valore di Km viene usato come indicatore dell'affinità dell'E per il suo S, in realtà questo è vero solo se k2 << k-1, e cioè quando k2 diventa trascurabile e Km = k-1/k1 = Kd.

Kd = costante di dissociazione di ES.
Km bassa: alta affinità dell’E per il S;
Km alta: bassa affinità dell'E per il S.

Quando abbiamo visto la tappa limitante di una reazione, abbiamo detto che è quella che avviene più lentamente rallentando l'intera reazione. Nel nostro es. era la costante di velocità (k2) della reazione di scissione di ES a dare E + P. Ma in reazioni più complesse la costante di velocità potrebbe essere k3 o k4...Quindi usando un termine più generico la costante di velocità della tappa limitante sarà indicata come kcat.

Vmax = k2 [Et] -->  kcat [Et]

kcat è detto anche numero di turnover = numero di molecole di S convertite in P nell'unità di tempo da un E saturato col suo S.

Ogni E ha i suoi valori di Km e kcat.

Per valutare l'efficienza catalitica di E diversi o dello stesso E con diversi S, basta fare kcat/Km, ottenendo così la costante di specificità di ogni E.