Amminoacidi, peptidi e proteine

struttura di un Aa

1 gr NH2 debolmente basico

1 gr COOH debolmente acido

enantiomeri

Gly

Ala

Val

Leu

Ile

Met

Pro

Phe

Tyr

Trp

Trp e Tyr assorbono la luce UV ad una lunghezza d'onda di 280 nm. Questa caratteristica viene usata nello studio delle proteine con lo spettrofotometro. Questa tecnica permette di identificare le molecole e di valutarne la concentrazione in soluzione.

Legge di Lambert-Beer 

A= ecl

A: assorbanza, direttamente proporzionale alla concentrazione di soluto

e: coeff di estinzione molare (Lt M cm)

c: concentrazione delle specie che assorbono la luce (M Lt)

l: lunghezza del cammino ottico (cm)

Ser

Thr

Cys

2 Cys ossidate formano un legame disolfuro (ponte S-S), la cistina risultante può essere ridotta da agenti riducenti (es. mercaptoetanolo).

Cistina

 ESPERIMENTO DI ANFISEN

Anfisen denaturò e rinaturò la Ribonucleasi A.

Ribonucleasi A

1. denaturazione con urea

urea

2. riduzione con mercaptoetanolo (BME)

mercaptoetanolo

Il BME rompe i 4 legami disolfuro nella struttura nativa della ribonucleasi A, che diventa una proteina lineare random coil con 8 residui di Cys.

Rimuovendo BME e urea la proteina riacquisisce la sua struttura nativa, riformando i 4 legami S-S esattamente dove li aveva prima della riduzione.

Asn

Gln

Asp

Glu

a pH 7 sono ionizzati, si caricano negativamente sul C e vengono chiamati aspartato (l'acido aspartico) e glutammato (l'acido glutammico).

Lys

 pKa = 10,5

Arg

pKa = 12,5, Aa più basico! il gr guanidinico si presenta come ione guanidino.

His

pKa = 6,0, il gr imidazolo si presenta come ione imidazolico. Si comporta come catalizzatore acido-base.

comportamento acido-base dell'His

RIP.

• Gli amminoacidi con gruppo R non polare possono formare interazioni idrofobiche.
• Gli amminoacidi con gruppo R polare non carico possono formare legami H.
• Gli amminoacidi con gruppo R carico possono formare legami ionici.

                                                                       

comportamento acido-base degli Aa

curva di titolazione

titolazione di un Aa

nel 1° punto di flesso della curva si ha la forma cationica (carica netta positiva), nel punto mediano la forma zwitterionica (carica netta 0), nel 2° punto di flesso della curva si ha la forma anionica (carica netta negativa).

I tamponi sono soluzioni acido-base che minimizzano piccole variazioni di pH. 

La massima capacità tamponante è a pH vicini al pKa del tampone.

Es. Ala ha massima capacità tamponante a pH 2,4 e 9,8 cioè per i pKa del gruppo carbossilico e amminico. Il pH 6,1 corrisponde al PI dell'Ala, cioè alla sua forma zwitterionica, in cui la capacità tamponante è minima.

valori di pKa

gruppi ionizzabili degli Aa e loro pKa

L'equazione di Henderson-Hasselbalch mette in relazione il pH, il pKa e la concentrazione di un acido

  equazione all'equilibrio della dissociazione di un acido in acqua.

forma zwitterionica di un Aa

Uno zwitterione (ione dipolare) è una specie chimica con carica netta 0.

Gli Aa (con gr R non ionizzabile) diventano uno ione dipolare in soluzione acquosa.

Uno zwitterione può agire sia da acido (donatore di H+) che da base (accettore di H+). 

Una specie chimica che può agire sia da acido che da base è detta anfotera o anfolita.

Aa essenziali

Aa ramificati:
Valina: 10 mg/kg di peso corporeo
Isoleucina: 10 mg/kg di peso corporeo
Leucina: 10 mg/kg di peso corporeo

Legame peptidico

reazione di condensazione per la formazione del legame peptidico

direzione N, C terminale

Gli Aa che restano dopo l'eliminazione di H2O vengono detti residui.

Strategie x la purificazione delle proteine:

1 frantumazione o omogenizzazione delle cellule --> estratto grezzo.

2 centrifugazione 

3 frazionamento:

- salting out con solfato d'ammonio --> diminuisce la solubilità della proteina che precipita
- dialisi: permette di eliminare i sali, la proteina viene trattenuta, i sali diffondono attraverso la membrana.
- ultrafiltrazione
4 separazione
- cromatografia su gel: separa in base alla dimensione, intrappola proteine piccole in granuli di polimero di dimensioni controllate

beads per la cromatografia

- cromatografia a scambio ionico: separa in base alla carica, lega proteine cariche usando scambiatori cationici/anionici.

- cromatografia di affinità: la proteina d'interesse viene trattenuta da un ligando ad hoc.

cromatografia di esclusione molecolare

Elettroforesi

caricamento dei pozzetti

- elettroforesi su gel di policrilammide con sodio dodecilsolfato (SDS-PAGE): separa proteine cariche in base al peso molecolare, applicando un campo elettrico ad un determinato pH. Le molecole cariche negativamente migrano verso l'anodo, quelle positive verso il catodo. La veocità di migrazione varia proporzionalmente al rapporto massa/carica.

5 degradazione proteolitica

- degradazione di Edman: rimuove 1 residuo alla volta dall'estremità N-terminale 

6 purificazione e sequenziamento

- spettrometria di massa MALDI-TOF MS: le proteine vengono mescolate con una matrice che assorbe la luce, generando calore. La proteina viene ionizzata e rilasciata e raggiunge il rivelatore dopo un tempo di volo (Time Of Flight) correlato alla sua massa molecolare.

- cristallografia ai raggi X: diffrazione degli e- di atomi in un cristallo per determinare la struttura della proteina.

struttura delle proteine

reattivo di Sanger

uso del reattivo di Sanger

isotiocianato di fenile

degradazione di Edman