La funzione delle proteine: la mioglobina

L'O2 è poco solubile nei fluidi acquosi come il sangue, perciò viene trasportato da proteine che lo legano reversibilmente. 
Il Fe e il Cu sono metalli di transizione in grado di legare l'O.

posizione del Fe nella tavola periodica

configurazione elettronica del Fe

disposizione degli e- nel Fe

Ma il Fe così com'è legando l'O creerebbe delle forme radicaliche (ROS come O2- e OH-). La ferriMb (così come la ferriHb) non è in grado di leare O. 
Il Fe presente nei sistemi di trasporto dell'O nell'organismo umano è nel gruppo prostetico EME nella forma di ione ferroso (Fe2+).

Fe: 4s2  3d6
Fe2+: 3d6

Il Fe2+ forma 6 legami di coordinazione (dativi)
4 nel piano dell'EME con i 4 N pirrolici
2 perpendicolari al piano dell'EME: 1 con l'HisF8 prossimale e 1 con l'O

Fe2+ e protoporfirina

Gli atomi di N impediscono al Fe2+ di transitare nella forma Fe3+.

anello pirrolico

4 anelli pirrolici sono uniti da ponti metinici (-C=) a formare l'anello tetrapirrolico ciclico della porfirina.

Alla porfirina sono legati:
- 4 gr metile
- 2 gr vinile

- 2 gr propionile

i 6 legami dativi del Fe

Il Fe legando l'O2 cambia le sue proprietà elettroniche (ibridazione d2 sp3), per questo il sangue venoso (povero di O2) ha colore rosso scuro e il sangue arterioso (ricco di O2) ha colore rosso vivo.

diverso colore del sangue venoso e arterioso

sangue ossigenato a sx e deossigenato a dx

Poiché il legame Mb-O è reversibile è una reazione all'equilibrio.

Mb + O = MbO

La reazione è caratterizzata da una costante di equilibrio (o costante di associazione) Ka, che misura l'affinità della Mb per l'O.

Ka = [MbO] / [Mb] [O]

Quando la [O] è alta, satura la Mb, ma la sua concentrazione resta pressoché invariata.

Ka [O] = [MbO] / [Mb]

Mettendo in relazione i siti di legame occupati con quelli totali, otteniamo un valore frazionario Y.

Y = siti occupati / siti totali = [MbO] / [MbO] [Mb]

Sostituendo [MbO] con Ka [Mb] [O]:

Questa è l'equazione di un'iperbole!

curva di saturazione della Mb

Il valore di pO2 al quale metà dei siti sono occupati (Y = 0,5) è uguale a 1/Ka. L'inverso della costante di associazione è la costante di dissociazione Kd.

Il Kd è il valore di pO2 al quale la Mb è satura per metà.

Un valore basso di Kd corrisponde ad un'elevata affinità della Mb per l'O.

Poiché l'O è un gas, parlando in termini di pressione parziale:

La p50 nella Mb è molto bassa 2,6 mmHg (deve strappare l'O all'Hb), a pO2 fisiologica è completamente satura, mentre nel muscolo sotto sforzo l'Mb è satura al 60%.

Una p50 così bassa indica che la Mb è relativamente insensibile a piccole variazioni di pO2.

Struttura tridimensionale delle proteine

La  struttura  di  una  proteina  è  una  sola  ed  è  quella  NATIVA,  che corrisponde alla sua funzione biologica.

parziale valenza di doppio legame

dipolo elettrico

strutture limite di risonanza

libera rotazione a monte e a valle del legame peptidico

grafico di Ramachandran

La struttura primaria di una proteina è costituita dalla sequenza degli L-amminoacidi che la compongono.

legami H in un'alfa elica

struttura di un'alfa elica

alfa elica vista dall'alto/basso con i gr R sporgenti

Pro destabilizzante

Gly destabilizzante

a elica della cheratina

ponti S-S nella cheratina

    

 foglietto B parallelo

foglietto B antiparallelo

schematizzazione

fasi della sintesi del collagene

collagene

Biosintesi del collagene:
1. Trascrizione dell'mRNA

2. Formazione del pre-pro-peptide come primo prodotto della traduzione con una sequenza segnale sull'N-terminale. Una volta che la traduzione è terminata il pre-pro-collagene entra nel RE per l'elaborazione post-traduzionale.

3. Dall'alfa peptide al procollagene

- la sequenza di riconoscimento si dissolve --> propeptide

- formazione dell'idrossiprolina e dell'idrossilisina (importanti per la formazione di legami crocaiti) grazie agli enizmi prolil-idrossilasi e lisil-idrossilasi che richiedono vit. C come cofattore. vedi SCORBUTO

L-Prolina + α-ketoglutarato + O2 → 4-idrossiprolina + CO2 + succinato

idrossilazione della Pro

5-idrossilisina (HyLys)

4. glicosilazione (aggiunta di glucosio/galattosio) sui residui di HyLys nel Golgi. A questo punto i propeptidi si avvolgono in senso sinistrorso, 3 propeptidi si avvolgono su loro stessi a formare una tripla elica di procollagene.

glicosilazione dell'HyLys

5. aggiunta di oligosaccaridi nel Golgi e formazione di vescicole di secrezione.

6. formazione del tropocollagene: una volta fuori dalla cellula vengono rimosse le estremità ridondanti del procollagene ad opera dell'enzima peptidasi.

7. formazione delle fibrille collagene: l'enzima lisina ossidasi agisce sulla Lys e l'HyLys trasformando il C epsilon in un gruppo aldeidico (allisina) che può formare legami covalenti tra le molecole di tropocollagene.

formazione di legami crociati

allisina

formazione della deidroidrossilisinonorleucina

formazione della base di Shiff

striature periodiche del collagene

strutture delle proteine

Il ripiegamento di una proteina avviene attraverso una serie di stadi intermedi secondo un  meccanismo cooperaitvo gerarchico.

Con il procedere del processo di formazione di interazioni diminuisce il numero di conformazioni ammesse.

imbuto di ripiegamento

diffrazione ai raggi X

rotazione del nucleo dell'H

NMR

Protein Data Bank

Amminoacidi, peptidi e proteine

struttura di un Aa

1 gr NH2 debolmente basico

1 gr COOH debolmente acido

enantiomeri

Gly

Ala

Val

Leu

Ile

Met

Pro

Phe

Tyr

Trp

Trp e Tyr assorbono la luce UV ad una lunghezza d'onda di 280 nm. Questa caratteristica viene usata nello studio delle proteine con lo spettrofotometro. Questa tecnica permette di identificare le molecole e di valutarne la concentrazione in soluzione.

Legge di Lambert-Beer 

A= ecl

A: assorbanza, direttamente proporzionale alla concentrazione di soluto

e: coeff di estinzione molare (Lt M cm)

c: concentrazione delle specie che assorbono la luce (M Lt)

l: lunghezza del cammino ottico (cm)

Ser

Thr

Cys

2 Cys ossidate formano un legame disolfuro (ponte S-S), la cistina risultante può essere ridotta da agenti riducenti (es. mercaptoetanolo).

Cistina

 ESPERIMENTO DI ANFISEN

Anfisen denaturò e rinaturò la Ribonucleasi A.

Ribonucleasi A

1. denaturazione con urea

urea

2. riduzione con mercaptoetanolo (BME)

mercaptoetanolo

Il BME rompe i 4 legami disolfuro nella struttura nativa della ribonucleasi A, che diventa una proteina lineare random coil con 8 residui di Cys.

Rimuovendo BME e urea la proteina riacquisisce la sua struttura nativa, riformando i 4 legami S-S esattamente dove li aveva prima della riduzione.

Asn

Gln

Asp

Glu

a pH 7 sono ionizzati, si caricano negativamente sul C e vengono chiamati aspartato (l'acido aspartico) e glutammato (l'acido glutammico).

Lys

 pKa = 10,5

Arg

pKa = 12,5, Aa più basico! il gr guanidinico si presenta come ione guanidino.

His

pKa = 6,0, il gr imidazolo si presenta come ione imidazolico. Si comporta come catalizzatore acido-base.

comportamento acido-base dell'His

RIP.

• Gli amminoacidi con gruppo R non polare possono formare interazioni idrofobiche.
• Gli amminoacidi con gruppo R polare non carico possono formare legami H.
• Gli amminoacidi con gruppo R carico possono formare legami ionici.

                                                                       

comportamento acido-base degli Aa

curva di titolazione

titolazione di un Aa

nel 1° punto di flesso della curva si ha la forma cationica (carica netta positiva), nel punto mediano la forma zwitterionica (carica netta 0), nel 2° punto di flesso della curva si ha la forma anionica (carica netta negativa).

I tamponi sono soluzioni acido-base che minimizzano piccole variazioni di pH. 

La massima capacità tamponante è a pH vicini al pKa del tampone.

Es. Ala ha massima capacità tamponante a pH 2,4 e 9,8 cioè per i pKa del gruppo carbossilico e amminico. Il pH 6,1 corrisponde al PI dell'Ala, cioè alla sua forma zwitterionica, in cui la capacità tamponante è minima.

valori di pKa

gruppi ionizzabili degli Aa e loro pKa

L'equazione di Henderson-Hasselbalch mette in relazione il pH, il pKa e la concentrazione di un acido

  equazione all'equilibrio della dissociazione di un acido in acqua.

forma zwitterionica di un Aa

Uno zwitterione (ione dipolare) è una specie chimica con carica netta 0.

Gli Aa (con gr R non ionizzabile) diventano uno ione dipolare in soluzione acquosa.

Uno zwitterione può agire sia da acido (donatore di H+) che da base (accettore di H+). 

Una specie chimica che può agire sia da acido che da base è detta anfotera o anfolita.

Aa essenziali

Aa ramificati:
Valina: 10 mg/kg di peso corporeo
Isoleucina: 10 mg/kg di peso corporeo
Leucina: 10 mg/kg di peso corporeo

Legame peptidico

reazione di condensazione per la formazione del legame peptidico

direzione N, C terminale

Gli Aa che restano dopo l'eliminazione di H2O vengono detti residui.

Strategie x la purificazione delle proteine:

1 frantumazione o omogenizzazione delle cellule --> estratto grezzo.

2 centrifugazione 

3 frazionamento:

- salting out con solfato d'ammonio --> diminuisce la solubilità della proteina che precipita
- dialisi: permette di eliminare i sali, la proteina viene trattenuta, i sali diffondono attraverso la membrana.
- ultrafiltrazione
4 separazione
- cromatografia su gel: separa in base alla dimensione, intrappola proteine piccole in granuli di polimero di dimensioni controllate

beads per la cromatografia

- cromatografia a scambio ionico: separa in base alla carica, lega proteine cariche usando scambiatori cationici/anionici.

- cromatografia di affinità: la proteina d'interesse viene trattenuta da un ligando ad hoc.

cromatografia di esclusione molecolare

Elettroforesi

caricamento dei pozzetti

- elettroforesi su gel di policrilammide con sodio dodecilsolfato (SDS-PAGE): separa proteine cariche in base al peso molecolare, applicando un campo elettrico ad un determinato pH. Le molecole cariche negativamente migrano verso l'anodo, quelle positive verso il catodo. La veocità di migrazione varia proporzionalmente al rapporto massa/carica.

5 degradazione proteolitica

- degradazione di Edman: rimuove 1 residuo alla volta dall'estremità N-terminale 

6 purificazione e sequenziamento

- spettrometria di massa MALDI-TOF MS: le proteine vengono mescolate con una matrice che assorbe la luce, generando calore. La proteina viene ionizzata e rilasciata e raggiunge il rivelatore dopo un tempo di volo (Time Of Flight) correlato alla sua massa molecolare.

- cristallografia ai raggi X: diffrazione degli e- di atomi in un cristallo per determinare la struttura della proteina.

struttura delle proteine

reattivo di Sanger

uso del reattivo di Sanger

isotiocianato di fenile

degradazione di Edman